Xét Nghiệm Sinh Học Phân Tử Là Gì? Ứng Dụng Ra Sao?

Xét nghiệm sinh học phân tử là gì?

Xét nghiệm sinh học phân tử là thuật ngữ được sử dụng để chỉ các xét nghiệm nhằm mục đích phát hiện ra những chỉ thị sinh học ở mức độ phân tử. Ví dụ như một số đoạn Axit Nucleic, các gen hoàn chỉnh, thậm chí là những bộ gen của vi sinh vật.

Xét nghiệm sinh học phân tử là một phản ứng tổng hợp chuỗi gen PCR. Kỹ thuật này được xem là bước tiến nhảy vọt từ thành công của phương pháp nhận dạng và giải trình gen. Xét nghiệm sinh học phân tử giúp bác sĩ xác định tác nhân gây bệnh đúng và nhanh chóng để phục vụ cho quá trình chữa trị hiệu quả hơn.

Người ta bắt buộc phải dùng chứng dương và âm trong xét nghiệm sinh học phân tử. Chứng dương là những mẫu chứng chứa đoạn ADN/ARN mục tiêu đã biết trước đó. Chứng âm là các mẫu chứng sở hữu đoạn ADN/ARN mục tiêu giúp kiểm soát quá trình nhiễm chéo khi tiến hành những phản ứng. Xét nghiệm sinh học phân tử dùng 2 kỹ thuật chính đó là PCR và Real-time PCR:

Kỹ thuật tổng hợp PCR

Dựa vào phản ứng PCR có thể nhận diện vi khuẩn một cách nhanh chóng. Sẽ có khoảng 20 – 35 vòng trong mỗi phản ứng tổng hợp PCR. Sau mỗi vòng, DNA sẽ được khuếch đại theo hệ số mũ. Để cho ra kết quả chính xác, khi thực hiện kỹ thuật tổng hợp PCR cần lưu ý lấy bệnh phẩm trong nồng độ phù hợp và điều nhiệt đúng với từng giai đoạn.

Trường hợp có sai sót, phản ứng PCR sẽ xảy ra với hiệu suất thấp. Thậm chí có khả năng không xảy ra, làm phản ứng PCR âm tính dù bệnh nhân xuất hiện triệu chứng lâm sàng rất rõ ràng. Đôi khi vô tình để phản ứng nhiễm chéo giữa các mẫu chứng diễn ra khiến PCR dương tính ngay cả khi dấu hiệu lâm sàng của người bệnh không rõ ràng, rất mờ nhạt.

Kỹ thuật Real-time PCR

Real-time PCR cũng tương tự như kỹ thuật PCR. Tuy nhiên ở đây sẽ có thêm một thiết bị để ghi lại tín hiệu khi phản ứng tổng hợp PCR xảy ra. Kỹ thuật này sẽ dựa trên việc so sánh số vòng mẫu chuẩn và số vòng mẫu thử có được trong cùng một khoảng thời gian xảy ra phản ứng. Nhờ đó có thể tính được số vòng mẫu thử gấp bao nhiêu lần số vòng mẫu chuẩn. Sau dùng, kỹ thuật viên sẽ tính được nồng độ DNA của mẫu thử.

Những yêu cầu khắt khe về kỹ thuật và sự hạn chế

Xét nghiệm sinh học phân tử phải được tiến hành trong điều kiện rất khắt khe. Nếu không đảm bảo các quy định ấy sẽ cho ra những hạn chế, sai sót:

• Trong kỹ thuật tổng hợp PCR: Nếu việc điều nhiệt tức thời không đúng theo từng giai đoạn, nồng độ nguyên liệu chưa thích hợp thì phản ứng tổng hợp PCR sẽ có hiệu suất rất thấp, thậm chí chẳng xảy ra. Bên cạnh đó, vô ý làm các mẫu thử nhiễm chéo cũng khiến kết quả không chính xác. 
• Trong kỹ thuật Real-time PCR: Để kết quả chuẩn xác, yêu cầu phải có một mẫu chuẩn tốt nhất để tiến hành so sánh. Nếu không, độ chính xác của kết quả sẽ bị ảnh hưởng.

Mẫu chuẩn phải thật chính xác thì định lượng mẫu thử mới đúng. Để loại trừ trường hợp sai sót, thông thường kỹ thuật viên phải so sánh 1 mẫu thử với 5 mẫu chuẩn liên tiếp sở hữu nồng độ chênh lệch nhau. Cho đến khi kết quả của mẫu thử sau 5 lần so sánh với những mẫu chuẩn không chênh lệch quá giới hạn thì mới được chấp nhận. Điều này đòi hỏi kỹ thuật viên phải có chuyên môn và tính kiên nhẫn cao. Nếu không kết quả sẽ có sự sai lệch. Xét nghiệm sinh học phân tử có 2 hạn chế điển hình: 

• Mẫu thử với mẫu chuẩn không đúng với mọi nồng độ. Nó chỉ đúng trong phạm vi nồng độ giới hạn. Do đó, kỹ thuật viên chỉ có thể tiến hành định lượng mẫu thử trong phạm vi nồng độ được giới hạn. Kết quả sẽ không chính xác nếu thực hiện ngoài khoảng đó.
• Hiện có rất nhiều loại vi sinh vật gây bệnh. Trong khi chúng ta chỉ mới “giải trình tự gen” của một số ít vi sinh. Thế nên không phải bệnh lý nào do vi sinh gây ra cũng có thể tiến hành chẩn đoán bằng kỹ thuật xét nghiệm sinh học phân tử. 

Như vậy, dù là phương pháp hiện đại nhưng xét nghiệm sinh học phân tử vẫn tồn tại những hạn chế, có thể gây ra sơ sót từ quá trình thực hiện của kỹ thuật viên.

Ứng dụng xét nghiệm sinh học phân tử trong chẩn đoán HBV và HIV

Dưới đây là ứng dụng của xét nghiệm sinh học phân tử trong việc chẩn đoán HBV và HIV:

Xét nghiệm sinh học phân tử ở HBV

Người ta có thể ứng dụng các xét nghiệm sinh học phân tử để làm HBV đo tải lượng hệ thống tự động. Qua đó giúp nhận diện HBV đồng thời xác định được số lượng virus trước khi tiến hành chữa trị. Đồng thời, chúng ta cũng theo dõi được số lượng virus trong suốt khoảng thời gian điều trị, quan sát và đánh giá sự tăng giảm để kịp thời đưa ra phương pháp cải thiện: 

• Bệnh phẩm sử dụng: 1,2 ml huyết tương của bệnh nhân hoặc 4 ml máu chống đông EDTA.
• Sẽ có kết quả xét nghiệm sau 3 ngày.

HBV đo tải lượng Real-time PCR: Như đã đề cập ở trên, nó tương tự như PCR nhưng có thêm thiết bị tính toán về khoảng thời gian phản ứng PCR xảy ra để xác định nồng độ và số lượng của mẫu thử trong giai đoạn này. Bên cạnh đó, có thể giúp chẩn đoán một cách chính xác về tình trạng, giai đoạn bệnh cũng như sự phát triển của các yếu tố gây bệnh. 

Bên cạnh đó, để việc chẩn đoán được chính xác hơn, còn ứng dụng thêm các kỹ thuật:

• Định tính HBV thông qua kỹ thuật PCR: Giúp phát hiện DNA của HBV có trong tế bào gan hoặc máu ngay cả khi HBsAg đã biến mất. Phương pháp này có độ đặc hiệu và độ nhạy cao.
• Dùng kỹ thuật giải trình tự hoặc RFLP để xác định kiểu gen HBV. HBV cũng sở hữu 8 kiểu gen khác nhau. Trong số đó, Genotype là kiểu liên quan khá nhiều đến sự tiến triển của bệnh, hiện tượng đột biến và kháng thuốc. Nghiên cứu lâm sàng cho thấy Genotype C có nguy cơ đột biến và ung thư cao hơn Genotype B, đồng thời đáp ứng kém với những loại thuốc kháng virus. Thế nên, việc xác định kiểu gen sẽ có ý nghĩa quan trọng trong việc điều trị, chẩn đoán, tiên lượng bệnh. 
• Xét nghiệm sinh học phân tử còn có thể tham gia vào quá trình xác định khả năng kháng thuốc của người bệnh viêm gan B mạn tính. 

Tương tự như hình thức xét nghiệm sinh học phân tử ở HBV, với HCV người ta cũng định tính thông qua kỹ thuật PCR, xác định kiểu gen HCV và đo tải lượng virus HCV. 

Xét nghiệm sinh học phân tử ở HIV

Người ta sẽ dùng xét nghiệm sinh học phân tử để đo tải lượng hệ thống tự động. Qua đó giúp kỹ thuật viên định lượng virus đang tồn tại bên trong cơ thể. Lúc này, bác sĩ sẽ chẩn đoán chính xác hơn và đề ra phác đồ chữa trị tối ưu nhất.

• Bệnh phẩm để thực hiện xét nghiệm sinh học phân tử chẩn đoán HIV là 1,5 ml huyết tương hoặc 4 ml máu chống đông.
• Kể từ ngày làm xét nghiệm, kết quả sẽ có sau 1 tuần.

Trên lâm sàng hiện có rất nhiều vi sinh gây bệnh, đặc biệt là các chủng mới như SARS, HCV, HIV,… hay chủng nấm đơn giản. Nếu chỉ sử dụng kỹ thuật xét nghiệm vi sinh cổ điển sẽ đáp ứng chậm hoặc không thể xác định được tác nhân gây bệnh, ảnh hưởng đến quá trình chẩn đoán. Khi đó, xét nghiệm sinh học phân tử sẽ giải quyết được những hạn chế này, giúp bác sĩ đưa ra chẩn đoán chính xác, nhanh chóng. 

Tương tự như HIV, HBV, để chẩn đoán những bệnh lý khác như viêm gan C, nhiễm Adenovirus, Mycoplasma, Dengue Virus, nấm Chlamydia,… người ta cũng áp dụng xét nghiệm sinh học phân tử với kỹ thuật Real-time PCR, tổng hợp PCR.